产品货号:
YT510
中文名称:
Klenow片段(无外切酶活性)
英文名称:
Klenow Fragment,Exo-
产品规格:
100U
发货周期:
1~3天
产品价格:
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本制品是没有外切酶活性的Klenow片段,是大肠杆菌聚合酶I(E.coli.DNA polymerase I)的大片段(Large Fragment)缺失了外切酶活性的突变体。Klenow Fragment,Exo-保留了DNA聚合酶I的5'→3'聚合酶活性,但缺少完整的Klenow酶的5'→3'和3'→5'外切酶活性。
由于Klenow Fragment,Exo-没有外切酶活性,其在末端补平时经常会在3'末端额外加上1个或多个核苷酸,因此不能用于产生平末端而用于后续的连接。
5'突出末端的标记;随机引物法进行DNA标记;Sanger双脱氧法进行DNA测序等。
由大肠杆菌表达,表达基因的来源为突变的polA基因片段。
分子量:约68kDa(单体)。
纯度:不含DNA内切酶,不含RNase。
- 75℃加热10分钟或加入适量EDTA均可导致Klenow Fragment,Exo-失活。
- 金属离子螯合剂,无机焦磷酸盐(PPi),大剂量的无机磷酸盐(Pi)均对Klenow Fragment,Exo-有抑制作用。
37℃,30分钟内,催化10nmol脱氧核糖核苷酸(dNTPs)摻入到多聚核苷酸中所需的酶量定义为1个活性单位。
酶活性检测条件:
67mM potassium phosphate(pH7.4),6.7mM MgCl2,1mM 2-mercaptoethanol,0.033mM dATP,0.033mM dTTP,0.4MBq/ml[3H]-dTTP,62.5μg/mL poly(dA-dT)·poly(dA-dT)。
组分 | 规格 |
Klenow片段(无外切酶活性,5U/μL) | 20μL |
10×Reaction Buffer | 300μL |
保存:-20℃
25mM Tris-HCl(pH7.5),0.1mM EDTA,1mM DTT,50%(v/v)glycerol。
10×Reaction Buffer:
500mM Tris-HCl(pH8.0 at 25℃),50mM MgCl2,10mM DTT。
- 酶使用时宜存放在冰盒内或冰浴上,使用完毕后宜立即放置于-20℃保存。
- 本制品仅限于专业人员的科学研究用,不得用于临床诊断或治疗,不得用于食品或药品,不得存放于普通住宅内。
- 为了您的安全和健康,请穿实验服并戴一次性手套操作。
- 随机引物法进行DNA标记:
- 参考如下表格设置反应体系:
成分 用量 DNA 10μL(100ng) 10×Reaction Buffer 5μL 125μM random decamer or hexamer primer 10μL 无核酸酶的去离子水 至40μL 混匀后沸水浴孵育5~10分钟,立即置于冰浴冷却。进行后续步骤前离心沉淀液体。 dNTP Mixture(0.25mM each,without the labeled dNTP) 4μL [α-32P]-dNTP,~110 TBq/mmol(3000Ci/mmol) 1.85MBq(50μCi) Klenow片段 1μL(5U) 无核酸酶的去离子水 至50μL - 按上表设置好反应体系后,轻轻混匀(可以用移液器吹打混匀或用Vortex在最低速度轻轻混匀),随后离心沉淀液体。
- 对于random decamer primer,37℃孵育5分钟;对于random hexamer primer,37℃孵育10分钟。
- 加入4μL 0.25mM dNTP,混匀后37℃孵育5分钟。
- 加入1μL 0.5M EDTA,pH8.0终止反应。
- 取1μL上述液体用于检测标记的效率。
- 用Sephadex G-50或Bio-Gel P-60或其它适当试剂盒纯化标记好的探针。
- 参考如下表格设置反应体系:
- 双链DNA 5'突出(5'overhang)末端的标记:
- 参考如下表格设置反应体系:
成分 用量 Digested DNA 10~15μL(0.1~4μg) 10×Reaction Buffer 2μL [α-32P]-dNTP,~15-30 TBq/mmol(400-800Ci/mmol)
或[α-32P]-dNTP,~110 TBq/mmol(3000Ci/mmol)0.74 MBq(20μCi)
或2.96 MBq(80μCi)dNTP Mixture(2.5mM each,without the labeled dNTP) 2μL Klenow片段 0.2μL(1U) 无核酸酶的去离子水 至20μL - 按上述体系配好之后,轻轻混匀(可以用移液器吹打混匀或用Vortex在最低速度轻轻混匀),随后离心沉淀液体。
- 30℃孵育15分钟。
- 75℃孵育10分钟终止反应。
- 参考如下表格设置反应体系:
- 其他用途可以参考上述用途或适当的文献资料进行。
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